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Megazyme 直链淀粉试剂盒K-AMYL说明书

 

前言:
谷类淀粉的许多特性决定其最终用途,这些取决于直链淀粉/支链淀粉的比率。这些特性包括糊化和凝胶化,溶解度,抗性淀粉的形成以及整颗大米的烹饪和构造特性。因此,淀粉中直链淀粉含量的测定是淀粉加工的一个重要的质量参数。
最常用的测定谷物淀粉中直链淀粉含量的方法是利用电势,电流测定或直链淀粉的碘结合能力比色测定直链淀粉-碘色合配合物。然而,这些方法具有不确定性。支链淀粉-碘复合物也可以形成,这样降低了利用非比色法测定的游离碘离子的浓度,并且用比色法测量时,该复合物可能和直链淀粉-碘复合物吸收相同波长的光。这种复合物致使直链淀粉的测定含量超过实际含量,需要进行校正。Gibson等详细列举了使用这些方法所遇到的许多其他问题。
支链淀粉结合ConA的特殊复合物为淀粉中直链淀粉的测定提供了一种替代方法,而且不存在不确定性问题。在指定pH值,温度和离子强度的条件下,ConA特异性结合分支多糖并形成沉淀,这种结合以多个非还原性末端基团上的α-D-吡喃葡萄糖基或α-D-吡喃甘露糖基单位为基础。因此,ConA可以有效结合淀粉中的支链淀粉成分,但是不能结合线性为主的直链淀粉成分。
此方法是Yun和Matheson改进的ConA方法。分析之前用乙醇预处理去除脂质。
原理:
淀粉样品通过加热完全地溶解在二甲基亚砜(DMSO)里。用乙醇沉淀淀粉去除其中的脂质,回收沉淀的淀粉。用醋酸/盐溶液溶解沉淀的样品,加入ConA,特异性沉淀支链淀粉,离心去除沉淀。单位体积上清液中的直链淀粉用酶水解为D-葡萄糖,然后用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂进行测定。另外一份单位体积醋酸/盐溶液中的总淀粉同样用酶水解为D-葡萄糖,然后加入葡萄糖氧化酶/过氧化物酶,用比色法测定。
根据ConA沉淀样品的上清液和与总淀粉样品中的GOPOD在510 nm处的吸光光度值之比判断直链淀粉在总淀粉中的含量。
该方法适用于所有的纯淀粉和谷物粉。
精确性
样品如为纯淀粉,相对标准偏差为<5%。
样品如为谷物面粉,相对标准偏差为~10%。
 
试剂盒:
瓶子1:冻干的Con A (伴刀豆球蛋白 A concanavalin A) ,200 mg,-20℃下稳定性>5年。
瓶子2:淀粉葡糖苷酶【200U,条件为消化对硝基苯基β-麦芽糖苷(也就是3300U,条件为pH4.5,40℃下消化淀粉)】加上真菌α-淀粉酶(500U ,条件为pH5.0,40℃下消化 Ceralpha 试剂),2mL,4℃下稳定性>5年。
瓶子3:GOPOD 试剂缓冲液。磷酸钾缓冲液(1M,pH7.4),对羟苯甲酸(0.22M)和叠氮化钠(0.02% W/W)。4℃下稳定性> 3年。
瓶子4:GOPOD试剂酶。葡糖氧化酶(>12,000U)加上过氧化物酶(>650U)和4-氨基安替比林(80mg)。冻干粉,-20℃下稳定性>5年。
瓶子5:D-葡萄糖标准溶液(5 mL,1.0mg/mL)溶于苯甲酸0.2%(w/v)。室温下稳定性>5年。
瓶子6:淀粉参考样品(含有特定含量的直链淀粉),室温下稳定性>5年。

试剂制备的准备:
1、用50mlCon A试剂将瓶子1中药品溶解,分成适当的几部分存放在聚丙烯管中,尽可能在-20℃下使用或冷藏。-20℃下稳定性>2年。
2、用20ml醋酸钠缓冲液将瓶子2中的药品溶解,分成适当的几部分存放在聚丙烯管中,尽可能在-20℃下使用或冷藏。-20℃下稳定性>2年。
3、用蒸馏水将中的药品(GOPOD 试剂缓冲液)稀释至1L。现配现用。
(注意:如果瓶子3意外存放在-20℃下,一些盐可能会结晶。配制时要确保所有的结晶物质都溶解在1L的蒸馏水中)
4、用20ml GOPOD 试剂缓冲液溶解GOPOD试剂酶,并定量的转移到存放GOPOD 试剂缓冲液的瓶子中,用铝箔封住瓶子,避光保存。这种试剂黑暗中保存,2-5℃下能保存大约3个月,-20℃下稳定性大于12个月。
5、按提供的方法使用D-葡萄糖标准溶液淀粉参考样品,室温下稳定性>5年。
 
安全考虑:
1、DMSO对皮肤有刺激性,用的时候要格外小心。它通过皮肤被吸收,对皮肤和眼睛都有刺激性。穿保护装、戴手套,避免溶剂溅出。尽可能在通风橱中进行试验。
2、ConA通过呼吸、皮肤接触或摄入体内,对人体是十分有害的。这种伤害不可逆转,可能会致畸。在使用ConA结晶体球蛋白和含有ConA的溶剂时要穿保护装、戴手套和特制的面具。
3、叠氮化钠是有毒的化学试剂,必须要有专门的处理。它要添加特殊的缓冲液来充当防腐剂。毒性通过缓冲可以被消除,但是缓冲液必须在4℃下保存。
 
缓冲液或溶剂:
1、乙酸钠缓冲液(10mM,pH 4.5)
加5.9ml1.05g/ml的冰醋酸到900ml的蒸馏水中用4g/100ml的NaOH溶液调pH到4.5(大约30ml),加0.2g叠氮化钠,用蒸馏水定容至1L。室温下稳定性>2年。
2、ConA 浓缩液(600 mM, pH 6.4 乙酸钠缓冲液)
称取49.2g无水醋酸钠,175.5g氯化钠,0.5gCaCl2.2H2O 0.7 gMgCl2.6H2O 0.7 g MnCl2.4H2O ,用900 mL 蒸馏水将其溶解逐滴加入冰醋酸调pH为6.4,再用蒸馏水定容至1L。4℃下保存2周。(注意:配制这种复合缓冲液时,pH的调节特别重要,如果pH低于6.4,就会有沉淀物形成,就算pH再调回来,沉淀物也不会溶解。结果会导致缓冲液必须丢弃重新配制。)
3、ConA 溶液(使用浓度)
将30ml ConA 浓缩液用蒸馏水稀释至100ml。现配现用。
4、DMSO
分析纯试剂。室温下可保存5年。
 
预处理:淀粉样品事先用乙醇进行预处理,除去脂质。如果样品没有用乙醇进行预处理,在某些样品中测得的直链淀粉含量会低50%。
 
实验步骤:
A、淀粉预处理
1、准确称取淀粉或面粉样品至10ml的样品管中。记录样品重量精确到0.1mg。
2、加1ml DMSO至试管,在漩涡混合器中慢速混匀,在沸水浴中加热直至分散(大约1分钟)确保淀粉没有结团结块。
3、密封试管,高速混匀。沸水浴加热15min,再高速间歇混匀。
4、室温放置大约5min,加2ml 95%乙醇,混匀,再加4ml乙醇,盖上盖子,颠倒混匀。形成淀粉沉淀物,将试管静止15min(条件允许过夜静止)。
5、2000r,5min离心,弃去上清液,倒置在纸巾上10min,确保乙醇全部挥发。在接下来直链淀粉和淀粉的测定中使用此沉淀物。
6、加2ml DMSO到淀粉沉淀物中,将试管沸水浴15min(间或混匀),确保没有块状。
7、从沸水浴中取出试管,立即加入4ml ConA 溶液,将试管中药品转移至25ml容量瓶中。用 ConA 溶液定容。
                 (整个过程必须在2h内完成)
B、支链淀粉- ConA 沉淀物和直链淀粉的测定
 1、量取1mlA试剂到2ml的试管中,加0.54ml的ConA 溶液,盖上盖子,反复颠倒,混匀。避免样品起泡。
2、室温静置1h。14000r,10min,室温下离心。
3、转移1ml的上清液到15ml的离心管中,,加3ml100mM醋酸钠缓冲液,pH4.5,混合药品。轻轻塞住管口,沸水浴5min,使ConA变性。
4、将试管在40℃下水浴,平衡5min,,加1ml淀粉转葡萄糖苷酶和a-淀粉酶的混合物,40摄氏度下反应30min,2000r离心5min。
5、准确量取1ml上清液,加4ml GOPOD试剂,40摄氏度下反应20min,使空白试剂和D-葡萄糖标准液同时反应。
6、在510nm下测定每一个样品和D-葡萄糖标准液的吸光光度值。
 
C、总淀粉的测定
1、将0.5mlA溶液和4ml100mM乙酸钠溶液混合,pH 4.5
2、加1ml淀粉转葡萄糖苷酶和a-淀粉酶的混合物,40摄氏度下反应10min,
3、准确量取1ml上清液,加4ml GOPOD试剂,40摄氏度下反应20min。这个反应必须让样品和标准液按B部分同时进行。
 
 
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