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Megazyme 总淀粉检测试剂盒K-TSTA说明书

简介:

     酸水解法和酶法被广泛的应用于淀粉含量测定,酸水解法仅仅适用于纯净的淀粉样品,应用范围有限。酶法的前处理步骤上有各种变化,经过凝胶、液化和糊精化作用,糊精水解生成葡萄糖,最终以测量的葡萄糖计算淀粉含量。AACC方法76-11特殊之处在于:在高压蒸汽和碱性环境下淀粉糊化成为凝胶,然后再用淀粉葡糖苷酶将淀粉转化为葡萄糖进行测量。AACC方法76-11会低估某些样品的淀粉含量,包括高多糖玉米淀粉和众多的经过加工的谷物产品。今天应用的众多的测定方法都使用了联合处理方法,如在样品处理过程中或直接在淀粉凝胶化后使用耐热α-淀粉酶。对于难凝胶的样品(如高多糖玉米淀粉)使用了氢氧化钠或二甲基亚砜作为溶剂。为确保膳食纤维中的淀粉能够全部溶解,EnglystCummings(1988)总结的处理方法中使用了去分支酶,支链淀粉酶。

    为了测量极端样品得到满意结果,兼顾数量和可靠性,Megazyme提供了一个总淀粉分析试剂盒,基于使用耐热性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶。这一方法已被AOACAACC采用 (Method 76.13)

    最近,耐热淀粉酶可在低pH环境下使用。因此,我们更新了我们的总淀粉测量方法加入了这种酶。这一改进的最大益处在于可以在同一pHpH5.0)条件下进行耐热性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶孵育,简化步骤以及减少麦芽酮糖(抗耐热性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶水解)的产生。另一改进是使用己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶/ NADP+D-葡萄糖处理步骤(K-TSHK5)Megazyme总淀粉分析方法可以测量广泛范围内食品,饲料,植物和谷类产品(自然的或加工的)。对于大多数样品(例如小麦面粉),淀粉可以在100°C耐热性淀粉酶处理步骤中完全可溶。包含高水平抗性淀粉(例如高多糖含量玉米淀粉)样品,需要先用冷2 M KOH  DMSO进行预溶解。含可溶性淀粉和糊精的样品,无需进行耐热性淀粉酶处理。

 

原理:

     抗耐热性淀粉酶水解淀粉为可溶性分支麦芽糊精和去分支麦芽糊精。

 

 

样品中的抗性淀粉可用2M KOH进行预溶解,再用醋酸钠缓冲液进行中和再进行淀粉酶水解。或者用DMSO100°C进行溶解。

 

 

淀粉葡萄糖苷酶水解麦芽糊精至D-葡萄糖。

 

 

 

D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸脂,释放出(H2O2),再用过氧化氢酶催化进行显色反应,产生醌亚胺染料。

 

 

 

样品包含高水平的D-葡萄糖和麦芽糊精可以在分析前用80%乙醇进行洗涤。单个样品可在70分钟内完成测定。20个样品可在2小时内完成。

特异性,灵敏度,线性范围和精确性

此试剂盒专用于分析a-葡聚糖(包括淀粉,糖原,植物糖原和非抗性麦芽糊精)。

最小可区分的吸收值是0.01吸收值范围。这对应于1.0mgD-葡萄糖(或0.9mg淀粉)/L在最大样品体积1ml。检测极限:2.0mgD-葡萄糖(或1.8mg淀粉)/L,这对应于0.02吸光度区别在最大体积1ml中。

此试剂盒在5-100ugD-葡萄糖范围内呈线性。一个样品溶液的重复测定中,吸收值会有0.0050.010的波动。当样品体积为1ml时,这相当于0.05-1ml/L浓度的D-葡萄糖。如果样品在准备过程中被稀释,结果需要乘以稀释倍数。例如在样品准备时,样品称重,如10g/L,变异范围将在0.020.05g/100g

干扰:

如果D-葡萄糖的转化在5分钟内完成,不会产生干扰。可以通过加入D-葡萄糖至反应完成后试管内(例如50ug0.1ml)以检测干扰。可以看到吸光度显著上升。

样品内的干扰物质可以通过加入内标进行分析。可以对这标准进行定量校正。样品操作中的损失可以通过在起始步骤中加入D-葡萄糖进行校正。

试剂盒成分

Megazyme总淀粉含量测定试剂盒提供有足够运行100次试验的试剂,并提供有全部的试验方法:

1: 耐热α-淀粉酶(10mL, 3,000U/mLCERALPHA试剂中pH6.5; 40°C 或1600U/mLCERALPHA试剂中pH5.0; 40°C)。稳定性>4, 4°C保存。

2: 淀粉葡糖苷酶(10mL, 3300U/mL在可溶性淀粉)(或200U/mLp-nitrophenylβ-maltoside*pH4.540°C)稳定性>4, 4°C保存。

完整的分析程序可在www.megazyme.com获得。

3: GOPOD试剂缓冲液。磷酸钾缓冲液(0.26MpH7.4),对羟基苯甲酸(0.22M),叠氮化钠(0.4%W/V)稳定性>4, 4°C保存。

 注意:

1. 如果GOPOD缓冲液存储在-20°C,会形成盐结晶,用双蒸水稀释至1L前必须完成溶解。

2. 此溶液含叠氮化钠(0.4%W/V),有毒。 

         

4: GOPOD试剂酶。葡萄糖氧化酶(> 12,000 U) 和过氧化物酶(> 650 U)4-氨基安替比林(80mg)。冻干粉,稳定性>4-20°C保存。

5: 葡萄糖标准溶液(5ml1mg/mL)在0.2% W/V苯甲酸溶液中。稳定性>4年,室温保存。      

6: 标准的玉米淀粉。淀粉含量见标签。稳定性>4-20°C保存。

准备试剂溶液

溶液1  用试剂1100mM醋酸钠缓冲液, pH5.0,自备)稀释1.0mL1成分至30mL 。分成小份后冻存。稳定性>3-20°C保存。

注意:如果按照AOAC方法996.11example b),用试剂450mM MOPS缓冲液,pH7.0)稀释酶。

溶液2  此酶不用稀释可以直接使用,由于酶溶液具有一定粘稠度,所以必须使用正确的移液器。4°C下保存,稳定性>3年。

溶液3  用蒸馏水稀释瓶3成分(GOPOD试剂缓冲液)到1L, 立即使用。

溶液20ml溶液3溶解瓶4成分再倒回溶液3瓶子。铝箔纸包裹避光。这就是          葡萄糖测定试剂(GOPOD试剂稳定性: 4°C下保存,3个月;-20°C下保存,              12个月; 

        分装成小份再进行冻存,只能冻融一次。

        新鲜配制的试剂呈浅黄色或浅紫色。4°C下保存2-3个月过程中,逐渐变成深紫色。用水为空白对照时,此溶液的吸光度<0.05

溶液5&6 同瓶5&6

              

自备试剂

1.醋酸钠缓冲液(100mM, pH5.0) +氯化钙(5mM) 

     5.8ml冰醋酸(1.05g/mL)加入900mL蒸馏水,1M(4g/100mL)NaOH调节pH5.0,大约需要30mL4°C下保存2个月.

     添加0.74g二水氯化钙完全溶解定容到1L,  4°C下保存>6个月。

注意:可通过添加叠氮化钠(0.2g/L)增加此缓冲液的稳定性。室温2年。必须在pH调完后再加入叠氮化钠。酸化的叠氮化钠会释放出有毒气体。

2.醋酸钠缓冲液(1.2M, pH3.8) 

     69.6ml冰醋酸(1.05g/mL)加入800mL蒸馏水4M NaOH调节pH3.8, 定容到1L。室温下保存12个月。

3.氢氧化钾溶液(2M

加入112.2 g KOH 900 mL 去离子水,搅拌溶解,定容一升。储存于密闭容器。室温下>2年。

4. MOPS缓冲液(50mM,pH7.0)+氯化钙(5mM) +叠氮化钠(0.02%)(仅用于example b分析样品)

    11.55g MOPS(钠盐, Sigma cat. M-9381)加入900mL蒸馏水1M(10%V/V)HCl调节pH7.0,大约需要17mL。 添加二水氯化钙(0.74g)和叠氮化钠(0.2g), 完全溶解然后调整到1L, 4°C下保存6个月。

5. 醋酸钠缓冲液(200mM,pH4.5)+叠氮化钠(0.02%)(仅用于example b分析样品)

冰醋酸(11.8mL,1.05g/mL)加入900mL蒸馏水1M(4g/100mL)NaOH调节pH4.5,大约需要60mL。加入叠氮化钠(0.2g),完全溶解,然后调整到1L, 4°C下保存6个月。

注意:可通过添加叠氮化钠(0.2g/L)增加此缓冲液的稳定性。室温2年。必须在pH调完后再加入叠氮化钠。酸化的叠氮化钠会释放出有毒气体。

设备:

              1.玻璃试管(圆底;16x120mm18x150mm)

              2.离心机(3,000rpm)

              3.微量移液器(100uL).

              4.连续分配器

              5.分析天平.

              6.分光光度计510nm.

              7.漩涡混合器

              8.定时钟

              9.沸水浴锅和试管夹

注意事项:

1.GOPOD试剂的孵育时间没有严格规定,但是至少要20分钟,并在60分钟内测定吸光度.

2.每次试验必须设定试剂空白对照和葡萄糖对照(100μg, 四倍)

    a)试剂空白对照: 0.1mL蒸馏水+3.0mLGOPOD溶液

    b)葡萄糖对照包括:0.1mL葡萄糖标准溶液(100μg/0.1mL)+3.0mLGOPOD溶液。因子F(页码1314)通过D-葡萄糖在标准分析中读得的吸光度进行计算(例如100/1.038=96.386)。

3.每次试验必须设定标准面粉或淀粉样品

4.每一新批此的GOPOD溶液,必须验证其与100μg葡萄糖标准反应产生颜色所需要的最长时间通常为15分钟左右。

样品空白:

    样品空白按照标准试验程序(example A)进行,将第4步修正为添加3mL蒸馏水,5步中也用蒸馏水替代其中的淀粉葡糖苷酶.也可以用样品前处理中所用的酒精作为样品空白( example E)

样品准备示例

A.不含抗性淀粉,D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物(建议的程序,pH5.0孵育)。

1.研磨谷物0.5mm筛(35)。

2.将研磨后样品(准确称量~100mg)加入到试管中(16x120mm),确保全部样品位于试管底部。

3.加入0.2mL乙醇溶液(80%v/v)湿润样品帮助分散用漩涡混合器混合。

4.立即加入3mL耐热α-淀粉酶(100mM醋酸钠稀释), 在沸水浴中孵育6分钟(在孵育2分钟,4分钟,6分钟的时强烈振荡试管).

    注意:在这一步中强力震荡是关键,目的是确保浆状样品能完全的混匀(去除块状)。同样,每间隔2分钟振荡也是为了防止由于酒精蒸发导致某些样品被喷出试管。如果使用聚丙烯管,增加孵育时间至12分钟,在 4, 812强烈震荡。 

5.将试管放置于50°C的水浴锅中加入0.1mL2成分(淀粉葡糖苷酶,330U在淀粉上)。充分混合,50°C下孵育30分钟。

6.将全部的溶液转移到100mL的容量瓶中,用洗瓶冲洗试管,并也倒入容量瓶中,然后用蒸馏水调整溶液体积充分混匀。取部分溶液离心(3,000rpm,10分钟)。取清澈的未稀释的上清用于分析。

     注意:对于含有1-10%淀粉的样品,在第6步中用蒸馏水调整溶液至10mL,充分混匀,离心(3,000rpm,10分钟),该溶液可以直接进行第7.对于含10-100%淀粉的样品,用蒸馏水稀释1.0mL样品液到10mL再进行第7步。

7.转移两份稀释的样品溶液(0.1mL)到园底试管中(16x100mm)

8.加入3.0mLGOPOD溶液到每一个试管中(包括葡萄糖对照和试剂空白对照), 然后在50°C下孵育20分钟

9.葡萄糖对照包括0.1mL葡萄糖标准溶液(1mg/mL)+3.0mLGOPOD溶液。              试剂空白对照: 0.1mL蒸馏水+3.0mLGOPOD溶液

10.相对于试剂空白在510nm下测定每一个样品和葡萄糖质控的吸光度。

 

B.不含抗性淀粉,D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物(AOAC 996.11)。

1.研磨谷物0.5mm筛(35)。

2.将研磨后样品(准确称量~100mg)加入到试管中(16x120mm),确保全部样品位于试管底部。

3.加入0.2mL乙醇溶液(80%v/v),用漩涡混合器混合。

4.立即加入3mL耐热α-淀粉酶(50mM MOPS稀释), 在沸水浴中孵育6分钟(在孵育2分钟,4分钟,6分钟的时强烈振荡试管).

    注意:在这一步中强力震荡是关键,目的是确保浆状样品能完全的混匀(去除块状)。同样,每间隔2分钟振荡也是为了防止由于酒精蒸发导致某些样品被喷出试管。如果使用聚丙烯管,增加孵育时间至12分钟,在 4, 812强烈震荡。 

5.将试管放置于50°C的水浴锅中加入醋酸钠缓冲液(4ml200mMpH4.5),加入0.1mL2成分(淀粉葡糖苷酶, 20U)。充分混合,50°C下孵育30分钟。

6. 按照example A 步骤6继续实验。

 

C.含抗性淀粉,不含D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物(建议KOH溶解)

1.研磨谷物0.5mm筛(35)。

2.将研磨后样品(准确称量~100mg)加入到试管中(16x120mm),确保全部样品位于试管底部。

3.加入0.2mL乙醇溶液(80%v/v),用漩涡混合器混合。

4.放入搅拌架子,加入2ml 2M KOH至每个试管中,冰水混合浴中搅拌20分钟左右,重悬粉末和溶解抗性淀粉。

注意:

1.不要使用涡旋仪混匀,会使淀粉乳化。

2.确保加入KOH时,试管处于剧烈震荡状态。这是为了避免淀粉形成团块难以溶解。

5.当试管在磁力搅拌器上搅拌时,加入8ml 1.2M醋酸钠缓冲液(pH3.8)至每个试管。立即加入0.1ml耐热α-淀粉酶(瓶1)和0.1mL淀粉葡糖苷酶(瓶2),充分混合,50°C下孵育

6. 孵育30分钟,间断混匀。

7. 样品淀粉含量>10%:将全部的溶液转移到100mL的容量瓶中,用洗瓶冲洗试管,并也倒入容量瓶中,然后用蒸馏水调整溶液体积至100ml, 充分混匀。取部分溶液离心(1800g,10分钟)

8. 样品淀粉含量<10%:直接离心(1800g,10分钟)。总体积约10.4ml(此体积可能有一定波动,特别是湿样品用于分析时,估计体积用于计算)。

9. 按照example A 步骤7继续实验。

 

 

 

 

D.含抗性淀粉,不含D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物(AOAC 996.11 DMSO溶解)

1.研磨谷物0.5mm筛(35)。

2.将研磨后样品(准确称量~100mg)加入到试管中(16x120mm),确保全部样品位于试管底部。

3.加入0.2mL乙醇溶液(80%v/v),用漩涡混合器混合。

4.立即加入2ml DMSO,涡旋混匀。沸水浴5分钟。

5.按照example A 步骤4继续实验。

 

E.D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物

1.研磨谷物0.5mm筛(35)。

2.将研磨后样品(准确称量~100mg)加入到试管中(16x120mm),确保全部样品位于试管底部。

3.加入5mL乙醇溶液(80%v/v)80-85°C孵育5分钟。涡旋混匀,再加入5ml乙醇溶液(80%v/v)

4.离心1800g3000rpm10分钟。去除上清。

5.10mL乙醇溶液(80%v/v)重悬沉淀。离心去除上清。

6. 按照example A 步骤4继续实验。

若样品含抗性淀粉,按照example C步骤4继续实验。

计算: 

 

           

ΔA=相对于试剂空白所读取的吸光度

 

    FV=总体积(例如100ml10ml

0.1 =样品分析体积

1/1000=转化从ugmg

100/w=淀粉作为干粉重量的比例。

W=干粉重量

162/180=D葡萄糖转化为脱氢葡萄糖

淀粉%(占干物质比重):=淀粉%X100/100-水分含量(%)

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