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Megazyme 交联β-葡聚糖含量试剂盒K-BGLU说明书

 

交联β-葡聚糖含量测定 AACC 32-23
6.2.1实验目的
在大麦、麦芽、麦芽汁和啤酒产品质量控制中经常需要测定其中的β-葡聚糖含量,Megazyme方法很好的解决了测定中的系列问题,本方法能够在一天内测定50-100个样品。本方法现在也适用于燕麦产品及燕麦纤维产品β-葡聚糖含量测定。
6.2.2实验原理
样品水化后加入真菌多糖酶在pH6.5缓冲液中培养,提取液离心(或过滤)后加入β-葡萄糖苷酶,在葡糖糖氧化-过氧化酶缓冲液保护下产生葡萄糖。
 
Megazyme测试包:(可以测定100个样品)
全套测定方法;真菌多糖酶;β-葡萄糖苷酶;葡糖糖标准液;大麦和燕麦纤维标准样品。
6.2.3实验试剂:
⑴真菌淀粉酶(bottle 1)〔(1-3)(1-4)β-D-葡萄糖4-葡聚糖水解酶〕:(活力>1000U/mL)
制备:1.0mL真菌淀粉酶用20mM NaH2PO4缓冲液(pH6.5)稀释至20.0mL。将溶液分装成5.0mL在冰箱中冷冻保存。最终真菌淀粉酶浓度50U/mL。
β-葡萄糖苷酶(bottle 2):(活力>40U/mL)
制备:将1.0mLβ-葡萄糖苷酶用50.0mM醋酸钠缓冲液(pH4.0)稀释至20.0mL。将溶液分装成5.0mL在冰箱中冷冻保存。最终β-葡萄糖苷酶浓度2U/mL。
⑶葡糖糖标准液:100μg0.1mL,用0.2%叠氮化钠溶液溶解。
⑷大麦标准样品:含量见标签。
⑸燕麦纤维标准样品:含量见标签。
⑹NaH2PO4缓冲液制备(20mM,pH6.5):3.12g NaH2PO4-2H2O溶解于900ml蒸馏水中,用100mM氢氧化钠溶液(4g/L)将pH值调至6.5(大约需50mL),加0.2g叠氮化钠,将溶液定容至1L。4℃保存。
⑺醋酸钠缓冲液(50mM,pH4.0):饱和醋酸(2.9mL)加入900mL蒸馏水,用1M氢氧化钠调节pH值至4.0,加0.2g叠氮化钠,将溶液定容至1L,4℃保存。
⑻葡萄糖氧化-过氧化酶缓冲液:建议使用Megazyme测试包里的高纯度葡萄糖氧化溶液和葡糖糖过氧化酶。将测试包的葡萄糖工作液(bottle 3)(50mL)稀释至1L。把测试包中的葡萄糖测定液(bottle 4)用1L葡萄糖工作液溶解(简称GOPOD)。为了保证GOPOD溶液的稳定性,应该在低温条件下在棕色瓶中避光保持。测定过程中从冰箱中取出的凉的GOPOD溶液可以直接加入测定管。
葡萄糖工作液包括:CaHPO4-2H2O(136.0g),NaOH (42.0g),酸(30.0g),叠氮化钠(4.0g)。
6.2.4仪器需求:
⑴聚丙烯具塞试管(35mL);
⑵移液器:量程分别为100μL,200μL,5.0mL(用于Na2HPO4缓冲液和葡萄糖氧化-过氧化酶缓冲液),25mL(用蒸馏水)。
⑶顶载天平:1/1000g。
⑷漩涡混合器;
⑸分光光度计:510nm。
⑹水浴锅:40℃和100℃水浴锅各一个。
⑺秒表:一只。
⑻离心机:离心力100g。
⑼试验粉碎机:细度0.5mm。
6.2.5测定步骤:
⑴将燕麦用试验粉碎机粉碎成细度0.5mm的颗粒。
⑵仔细称量燕麦粉样品(0.5g左右),放入35mL聚丙烯具塞试管。样品需要已知水分含量,以便最后转为干基。
⑶向试管中加入1.0mL 50%(v/v)的乙醇溶液,使样品充分润湿。
⑷加入5.0mL NaH2PO4缓冲液(20mM,pH6.5),在漩涡混合器上充分混合。
⑸将试管放入100℃水浴锅中保温5min。每隔0.5min取出快速在漩涡混合器上混合。前2.0min加热及混合效果对于结果影响较大。
⑹将试管在室温下降至40℃,向每个试管加入0.2mL真菌淀粉酶(10U)。试管加盖,震荡混匀,放入40℃水浴锅中保温1h。每隔10min将样品在漩涡混合器上混合。
⑺向每个试管加入24mL蒸馏水,将溶液体积调整为30mL。
⑻将试管放入离心机中,在1000g离心力下离心10min。
⑼用移液枪移取0.1mL样品液,分别放入3个玻璃试管。一个玻璃试管作对照,另外两个为代测样品。
⑽按如图6.1所示加入试剂。黑色方框为比色杯。一次可以同时完成11个样品的测试。
⑾将玻璃试管放入40℃水浴锅中保温15min。
⑿向每支试管加入3.0mL GOPOD溶液,在40℃水浴锅中保温20min。
 
⒀将试管中液体转入1.0cm比色杯,在510nm测定吸光度。1h内完成测定。
⒁计算β-葡聚糖含量:
样品干重=样品重量×(100-水分含量)/100
β-葡聚糖含量(% w/w)=吸光度×F×300×(1/1000)×(100/W)×(162/180)
=吸光度×(F/W)×27
F=100/葡糖糖标准溶液吸光度;
300为体积校正系数;
162/180为将游离葡萄糖转化为脱水葡萄糖;
W=样品干重;
 
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